Laboratoř molekulární biologie rostlin PřF JU

Obsluha přístrojů

• Přístroj se zapíná/vypíná černým tlačítkem (hlavní spínač) vlevo na přední straně přístroje.
• K pohybu po displeji a výběru požadované (zvýrazněné) volby slouží šipkové klávesy.
• Číselná tlačítka vpravo na přístroji (klávesnice) slouží k psaní textu, vkládání hodnot; opakovaným stiskem se přepíná mezi malými a velkými písmeny; klávesa 1 slouží k vkládání mezery; klávesa „C“ = backspace.
• Červené tlačítko (Escape/Cancel) slouží k návratu do předchozího kroku; zastavení měření.
• Modré tlačítko (0A/100%T) slouží k nastavení blanku.
• Zelené tlačítko (Enter) slouží k potvrzení výběru a k provedení měření
• Pro měření koncentrace DNA zvolíme stisknutím příslušného čísla funkci „Life Science“ › „Nucleic Acid“ › „DNA“
• DNA neměříme přímo, ale zředěnou (koncentrace by mohla být mimo měřitelnost přístroje a hlavně – nemusíme svojí DNA plýtvat); minimální množství roztoku v kyvetě je 70 µl
• Zadáme ředění vzorku („Dilution Factor“), např. při ředění 1:13 (5 µl DNA + 65 µl vody) je ředící faktor 14; zvolíme jednotky (ng/µl) a potvrdíme nastavení (ostatní parametry necháme v původním nastavení)
• Připravíme si referenční vzorek (blank). Bude jím buď voda nebo roztok, ve kterém je DNA skladována (Elution Buffer D z kitu, TE pufr, apod.) – ve druhém případě tento roztok ředíme vodou stejným poměrem jako budeme používat pro měření DNA.
• Vložíme kyvetu s referencí a stiskneme modré tlačítko pro nastavení blanku, přístroj ukáže nulovou absorbanci
• Při měření používáme stále stejnou orientaci kyvety (jedna strana kyvety je opatřena šipkou)
• Kyvetu několikrát vypláchneme destilovanou vodou ze střičky, kapky vody z kyvety vyklepeme na buničinu, příp. vysajeme zbytek vody ze dna kyvety pipetou. Kyvetu opakovaně proplachujeme mezi jednotlivými vzorky.
• Do kyvety pipetujeme zvolené množství vody a DNA, promícháme pipetováním, vložíme kyvetu se vzorkem do přístroje a stiskneme zelené tlačítko pro měření; přístroj ukáže koncentraci našeho originálního vzorku DNA (nikoliv koncentraci v kyvetě!)
• Zaznamenáme hodnoty z displeje
• Po skončení měření vyjmeme kyvetu a přístroj vypneme
• Kyvetu necháme odmočit v jarové vodě, vypláchneme destilovanou vodou a necháme vyschnout na kousku buničiny

• přístroj se zapíná v zadní části přístroje vedle přívodní šňůry
• přístroj ovládáme pomocí tlačítek F1–F5 dole pod displejem; pohybujeme se pomocí šipek vlevo na přístroji, potvrzujeme Entrem
• po spuštění se na základní obrazovce objeví tři ikony:
• ikona File – po stisknutí se zobrazí seznam uživatelů (Users), názvy souborů (File name) datum vytvoření programu (Save date)
• ikona System – systémová nastavení, např.: nastavení teploty víka, zapnutí/vypnutí zvukového signálu po skončení programu
• ikona Run

Vytvoření nového programu

• Pokud chceme měnit parametry stávajícího programu označeného kurzorem, stiskneme klávesu Edit
• Pro vytvoření nového programu stiskneme klávesu F2 (New File)
• Stiskem klávesy F1 (+Seg) zadáváme parametry jednotlivých kroků (tzv. segmentů) jako teplotu (Temp), čas (Time), rychlost nárůstu/poklesu teploty (tzv. Ramping rate – Ramp); přednastavená hodnota „#.#“ ve sloupci Ramp značí nejvyšší možnou rychlost nárůstu/poklesu teplot
• Stiskem klávesy F2 (+Cycle) nastavíme počet cyklů a průběh cyklu, např. from 02 to 04
• Pro tzv. touchdown PCR využijeme sloupec +Temp a +Time
• Sloupec Grad slouží pro vytvoření parametrů teplotního gradientu, číslice 12 znázorňuje gradient 12 stupňů mezi první a poslední pozicí bloku; teplota mezi jednotlivými pozicemi se nastaví automaticky, její nárůst od první k poslední pozici je progresivní
• Po vytvoření programu stiskneme klávesu F5 (Save), zadáme jméno uživatele a název vytvořeného programu a potvrdíme klávesou F3 (Save)

Spuštění programu

• Vložíme PCR zkumavky, stripy nebo destičku se vzorky.
• Zaklapneme víko bloku a dotáhneme (ne silou!)
• Stiskneme klávesu F1 (File), vyhledáme svůj uživatelský profil a po označení příslušného programu kurzorem stiskneme klávesu F5 (Run)
• Po spuštění programu se na displeji zobrazí jméno uživatele, název programu, celkový čas, zbývající čas, číslo a grafický průběh právě probíhajícího cyklu, počet cyklů, teplota víka apod.

Zastavení programu

• Po skončení programu stiskem klávesy Stop a opětovným potvrzením stiskem F1 (Stop).

• Přístroj se zapíná/vypíná na přední straně vpravo dole tlačítkem „Power“
• přístroj ovládáme pomocí tlačítek dole pod displejem a na pravé straně, pohybujeme se pomocí šipek, potvrzujeme Entrem, mažeme tlačítkem Cancel
• základní obrazovka ukazuje několik ikon:
• Ikona Info: zobrazení informací o blocích – právě činný (active) nebo volný (inactive)
• Ikona Systém – informace o typu přístroje, nastavení signalizace konce programu, navolení požadovaného jazyka, nastavení kontrastu na displeji apod.
• Ikona Start/stop – zapnutí/vypnutí programu
• Ikona Edit – vytvoření nového programu nebo změna parametrů již uloženého programu

Vytvoření nového programu

• Stiskneme klávesu Edit.
• Vybereme adresář, do kterého chceme program uložit, stiskneme Enter.
• Vybereme podadresář a klikneme na Edit.
• Po zobrazení abecedy vložíme název programu a potvrdíme stiskem Name OK.
• Nastavíme teplotu víka (Lid Temperature) na 99°C a zapneme funkci předehřívání (Preheating ON), potvrdíme stiskem Enter.
• Nastavíme teplotní program – teplotu (Temp) vkládáme čísly, čas (Time) zadáváme buď v sekundách nebo lze minuty, příp. hodiny oddělit tečkou („3.30“ znamená 3 min 30 s, „1.5.0“ znamená 1 hod 5 min 0 s,); pro nastavení chlazení po skončení programu stiskneme „0“, objeví se „Pause“
• Pro nastavení cyklování, najedu na konec řádku základního cyklu a do sloupce „‹“ vložíme číslo, které udává počáteční krok základního cyklu (k tomuto kroku, např. 2 se bude přístroj po každém dokončeném základním cyklu vracet a opakovat cyklus od tohoto kroku); do sloupce „#“ vložíme počet cyklů -1
• program uložím „Save pgm“

Spuštění programu

• Vložíme PCR zkumavky, stripy nebo destičku.
• Zaklapneme víko bloku a dotáhneme (ne silou!)
• Stiskneme Start/Stop, vybereme blok a po rozbalení adresáře program, který chceme spustit a stiskneme Start.
• Po spuštění programu se začne zahřívat víko, displej zobrazuje teplotu a čas právě probíhajícího kroku, teplotu víka; čas do konce programu se objeví po stisknutí „Info“.
• Ve chvíli, kdy víko dosáhne zadané teploty (standardně 99 °C), je automaticky přitlačeno na zkumavky, začíná vlastní reakce a na displeji je znázorňován průběh reakce.
• Po ukončení programu se zapne zvukový signál, povolíme víko a můžeme vyndat produkty PCR reakce.
• V průběhu PCR reakce je možné vytvářet či editovat další programy.

Kalibrace

• Doporučuje se provádět nejméně 1× týdně, pro přesné měření 1× denně.
• Pro kalibraci použijeme vždy pufr pH = 7,01 a druhý (pH = 4,01 nebo 10,01) zvolíme podle toho, jestli plánujeme měření v kyselé nebo v zásadité oblasti.
• Zapneme přístroj tlačítkem vpravo pod displejem, ukáže se hodnota pH a teplota.
• Elektrodu i teploměr důkladně opláchneme destilovanou vodou ze střičky, opatrně osušíme buničinou.
• Vložíme elektrodu i teploměr do kalibračního pufru pH = 7,01. Otvor na spodní části kyvety (nad baničkou) musí být pod hladinou pufru!
• Necháme chvíli ustálit, spustíme kalibraci tlačítkem „CAL“.
• Přístroj začne kalibrovat, vlevo bliká „Not ready“. Počkáme, dokud se nápis nezmění na „Ready CFM“, potvrdíme stiskem tlačítka „CFM“.
• Šipkami (označeny ↑°C / ↓°C) vybereme hodnotu pH druhého kalibračního pufru (zobrazuje se na displeji úplně vpravo).
• Vyjmeme elektrodu i teploměr z pufru, opláchneme destilovanou vodou, vysušíme a vložíme do druhého kalibračního pufru.
• Bliká „Not ready“, počkáme, dokud se nápis nezmění na „Ready CFM“, dokončíme kalibraci stiskem tlačítka„CFM“.
• Pokud ihned nepokračujeme měřením, vypneme přístroj.
• Vyjmeme elektrodu i teploměr, opláchneme destilovanou vodou, osušíme buničinou a vložíme do čepičky s uchovávacím pufrem (Storage solution; pokud v něm nebude ponořená celá banička elektrody, doplnit).

Měření pH

• Zapneme přístroj.
• Opláchneme elektrodu i teploměr destilovanou vodou, opatrně osušíme buničinou.
• Vložíme elektrodu i teploměr do roztoku, otvor na spodní části kyvety (nad baničkou) musí být pod hladinou.
• Na displeji se zobrazuje teplota a hodnota pH. Počkáme, než se hodnota pH ustálí.
• Po skončení měření, pokud nepokračujeme dalším roztokem, vypneme přístroj.
• Vyjmeme elektrodu i teploměr, opláchneme destilovanou vodou, osušíme buničinou a vložíme do čepičky s uchovávacím pufrem (Storage solution; pokud v něm nebude ponořená celá banička elektrody, doplnit).