Roztoky a pufry
1) Elektroforéza a příprava gelů
2) Izolace, ředění a srážení DNA
3) AFLP
4) Isozymy – izolace
5) Isozymy – barvení
6) Isozymy – fixace
7) Ostatní
1) Elektroforéza a příprava gelů
TBE pufr (zásobní roztok)
| 10× konc. | 20× konc. |
|---|
| Tris-base | 108 g | 216 g |
| Boric acid | 55 g | 110 g |
| Na2-EDTA | 9,3 g | 18,6 g |
| rozpustit v dest. H2O, doplnit do | 1000 ml | 1000 ml |
Ředění na konc. 1× (elektroforéza, příprava gelů):
| 10× konc. | 20× konc. |
|---|
| 1 l | 5 l | 1 l | 5 l |
| TBE | 100 ml | 500 ml | 50 ml | 250 ml |
| dest. H2O | 900 ml | 4500 ml | 950 ml | 4750 ml |
TAE pufr (10× konc. zásobní roztok)
| | 1000 ml |
|---|
| Tris-base | 48,46 g |
| Acetic acid (glacial) | 12,01 g |
| Na2-EDTA | 3,72 g |
| rozpustit v dest. H2O, doplnit do | 1000 ml |
Tris-glycine
| | 1 l | 3 l |
|---|
| Tris-base | 2,5 g | 7,5 g |
| Glycine | 18 g | 54 g |
| dest. H2O | ~ 900 ml | ~ 2700 ml |
| úprava pH pomocí HCl | pH = 8,3 |
| doplnit dest. H2O do objemu | 1 l | 3 l |
Ředění do spodní vany elektroforézy: Tris-glycine buffer 2400 ml + dest. H2O 1800 ml
Pufr pro separační gel – isozymy (1,82M Tris-HCl, pH = 8,9)
| | 50 ml | 100 ml | 200 ml |
|---|
| Tris-base | 11,05 g | 22,1 g | 44,2 g |
| dest. H2O | ~ 35 ml | ~ 80 ml | ~ 170 ml |
| úprava pH pomocí HCl | pH = 8,9 |
| doplnit dest. H2O do objemu | 50 ml | 100 ml | 200 ml |
Pufr pro zaostřovací gel – isozymy (69mM Tris-H3PO4, pH = 6,9)
| | 50 ml | 100 ml | 200 ml |
|---|
| Tris-base | 0,42 g | 0,83 g | 1,66 g |
| dest. H2O | ~ 35 ml | ~ 80 ml | ~ 170 ml |
| úprava pH pomocí H3PO4 | pH = 6,9 |
| doplnit dest. H2O do objemu | 50 ml | 100 ml | 200 ml |
Zásobní roztok akrylamidu
| | 100 ml | 200 ml |
|---|
| Acrylamide | 40 g | 80 g |
| N,N'-Methylenebisacrylamide (BIS) | 1 g | 2 g |
| rozpustit v dest. H2O, doplnit do: | 100 ml | 200 ml |
Pozor! Obě látky jsou velmi jedovaté, pracujeme v plášti, rukavicích a při vážení v roušce!
Loading buffer
| Bromphenol Blue | 0,025 g |
| Xylene Cyanol FF | 0,025 g |
| Glycerol | 3 ml |
| SYBR Green I | 20 µl |
| doplnit sterilní dest. H2O do objemu | 10 ml |
rozpipetovat po 1 ml, uchovávat ve tmě v –20°C.
100 bp Ladder (500 µg/ml) + LB
| 100 bp ladder | 20 µl |
| sterilní dest. H2O | 180 µl |
| Loading Buffer | 40 µl |
λ DNA Hind III digest (500 µg/ml) + LB
| λ DNA Hind III digest | 20 µl |
| sterilní dest. H2O | 180 µl |
| Loading Buffer | 40 µl |
2) Izolace, ředění a srážení DNA
TE pufr (10× koncentrovaný zásobní roztok)
| | 50 ml | 100 ml | 250 ml | 1000 ml | (konc.) |
|---|
| Tris-base | 0,61 g | 1,21 g | 3,03 g | 12,11 g | (0,1M) |
| Na2-EDTA | 0,19 g | 0,37 g | 0,93 g | 3,72 g | (0,1M) |
| dest. H2O | ~ 35 ml | ~ 80 ml | ~ 220 ml | ~ 900 ml | |
| úprava pH pomocí HCl / NaOH | pH = 8,0 | |
| doplnit dest. H2O do objemu | 50 ml | 100 ml | 250 ml | 1000 ml | |
T0.1E pufr (10× koncentrovaný zásobní roztok)
| | 50 ml | 100 ml | 250 ml | 1000 ml | (konc.) |
|---|
| Tris-base | 0,61 g | 1,21 g | 3,03 g | 12,11 g | (0,1M) |
| Na2-EDTA | 0,019 g | 0,037 g | 0,093 g | 0,37 g | (0,01M) |
| dest. H2O | ~ 35 ml | ~ 80 ml | ~ 220 ml | ~ 900 ml | |
| úprava pH pomocí 1M HCl | pH = 8,0 | |
| doplnit dest. H2O do objemu | 50 ml | 100 ml | 250 ml | 1000 ml | |
100mM Tris-HCl pufr, pH = 8,3
| | 50 ml | 100 ml | 250 ml |
|---|
| Tris-base | 0,61 g | 1,21 g | 3,03 g |
| dest. H2O | ~ 35 ml | ~ 80 ml | ~ 220 ml |
| úprava pH pomocí 1M HCl | pH = 8,3 |
| doplnit dest. H2O do objemu | 50 ml | 100 ml | 250 ml |
0,5M NaOH
–
viz část 7) Ostatní
2% CTAB
| | 100 ml | 250 ml | 500 ml | (konc.) |
|---|
| CTAB (cetyl trimethyl ammonium bromide) | 2,0 g | 5,0 g | 10,0 g | (2% w/v) |
| Tris-base | 1,21 g | 3,03 g | 6,06 g | (0,1M) |
| Na2-EDTA | 0,74 g | 1,86 g | 3,72 g | (0,02M) |
| NaCl | 8,18 g | 20,45 | 40,91 g | (1,4M) |
| dest. H2O | ~ 80 ml | ~ 220 ml | ~ 450 ml | |
| doplnit dest. H2O do objemu | 100 ml | 250 ml | 500 ml | |
Sodium acetate
| | 3M | 0,05M, pH = 5,0 |
|---|
| | 100 ml | 100 ml | 200 ml | 500 ml |
| Sodium acetate (anhydrous) | 24,61 g | 0,41 g | 0,82 g | 2,05 g |
| dest. H2O | - | ~ 80 ml | ~ 180 ml | ~ 450 ml |
| úprava pH pomocí kys. octové | - | pH = 5,0 |
| doplnit dest. H2O do objemu | 100 ml | 100 ml | 200 ml | 500 ml |
3) AFLP
R/L buffer (10× koncentrovaný)
| Tris-base | 0,121 g | (0,1M) |
| dest. H2O | 8 ml | |
| upravit pH pomocí kys. octové | pH = 7,5 | |
| magnesium acetate tetrahydrate | 0,214 g | (0,1M) |
| potassium acetate | 0,491 g | (0,5M) |
| dithiothreitol (DTT) | 0,077 g | (0,05M) |
| doplnit dest. H2O do objemu | 10 ml | |
rozpipetovat po 1 ml, uchovávat ve tmě v –20°C.
4) Isozymy – izolace
0,1M Tris-HCl pufr, pH = 8,3
| | 50 ml | 100 ml | 250 ml |
|---|
| Tris-base | 0,61 g | 1,21 g | 3,03 g |
| dest. H2O | ~ 35 ml | ~ 80 ml | ~ 220 ml |
| úprava pH pomocí HCl | pH = 8,3 |
| doplnit dest. H2O do objemu | 50 ml | 100 ml | 250 ml |
75mM Tris-H3PO4 pufr, pH = 7,5
| | 50 ml | 100 ml | 250 ml |
|---|
| Tris-base | 0,45 g | 0,91 g | 2,27 g |
| dest. H2O | ~ 35 ml | ~ 80 ml | ~ 220 ml |
| úprava pH pomocí H3PO4 | pH = 7,5 |
| doplnit dest. H2O do objemu | 50 ml | 100 ml | 250 ml |
Izolační pufr „Viola“ (podle isozymové laboratoře BÚ AVČR, Průhonice)
| | 30 ml | 50 ml | 100 ml | (konc.) |
|---|
| 0.1M Tris-HCl pH = 8.3 pufr | 30 ml | 50 ml | 100 ml | (0,1M) |
| ascorbic acid | 58 mg | 97 mg | 194 mg | (11mM) |
| sodium metabisulfite | 148 mg | 247 mg | 494 mg | (26 mM) |
| 2-mercaptoethanol | 148 µl | 246 µl | 492 µl | (70 mM) |
| úprava pH pomocí HCl | pH = 8,0 (před přidáním PVP!) | |
| PVP | 1,2 g | 2 g | 4 g | (4% w/v) |
Nelze dlouhodobě uchovávat, krátkodobě v lednici
Izolační pufr „Gentiana“ (podle isozymové laboratoře BÚ AVČR, Průhonice)
| | 30 ml | 50 ml | 100 ml | (konc.) |
|---|
| 0.1M Tris-HCl pH = 8.3 pufr | 30 ml | 50 ml | 100 ml | (0,1M) |
| L-glutathione reduced | 0,3 g | 0,5 g | 1 g | (1% w/v) |
| MgCl2.6H2O | 60 mg | 100 mg | 200 mg | (10 mM) |
| 2-mercaptoethanol | 30 µl | 50 µl | 100 µl | (0,1% v/v) |
| sucrose | 1,5 g | 2,5 g | 5 g | (5% w/v) |
Nelze dlouhodobě uchovávat, krátkodobě v lednici
Izolační pufr „Luzula“ (podle isozymové laboratoře BÚ AVČR, Průhonice)
| | 30 ml | 50 ml | 100 ml | (konc.) |
|---|
| 75mM Tris-H3PO4 pufr, pH = 7,5 | 30 ml | 50 ml | 100 ml | (75mM) |
| ascorbic acid | 15 mg | 25 mg | 50 mg | (3 mM) |
| 1,4-Dithioerythritol (DTE) | 36 mg | 60 mg | 120 mg | (7,8 mM) |
| 2-mercaptoethanol | 30 µl | 50 µl | 100 µl | (0,1% v/v) |
| PVP | 1,2 g | 2 g | 4 g | (4% w/v) |
Nelze dlouhodobě uchovávat, krátkodobě v lednici
5) Isozymy – barvení
Tris-HCl pufry
| | 0,1M Tris-HCl | 0,05M Tris-HCl |
|---|
| | 100 ml | 250 ml | 500 ml | 100 ml | 250 ml | 500 ml |
|---|
| Tris-base | 1,21 g | 3,03 g | 6,06 g | 0,61 g | 1,51 g | 3,03 g |
| dest. H2O | ~ 80 ml | ~ 220 ml | ~ 450 ml | ~ 80 ml | ~ 220 ml | ~450 ml |
| úprava pH pomocí HCl | pH = 8,4 | pH = 8,5 |
| doplnit dest. H2O do objemu | 100 ml | 250 ml | 500 ml | 100 ml | 250 ml | 500 ml |
Návod platí zásobní roztoky s nejvyšším používaným pH, pufry stejných koncentrací s nižším pH připravíme z těchto zásobních roztoků úpravou pH pomocí HCl.
Tris-Maleate (Tris-Maleic acid)
| | 0,1M Tris-Maleate, pH = 5,5 | 0,2M Tris-Maleate, pH = 6,0 |
|---|
| | 100 ml | 200 ml | 500 ml | 100 ml | 200 ml | 500 ml |
|---|
| Tris-base | 1,21 g | 2,42 g | 6,06 g | 2,42 g | 4,84 g | 12,12 g |
| Maleic acid | 1,16 g | 2,32 g | 5,80 g | 2,32 g | 4,64 g | 11,61 g |
| dest. H2O | ~ 80 ml | ~ 180 ml | ~ 450 ml | ~ 80 ml | ~ 220 ml | ~450 ml |
| úprava pH pomocí NaOH | pH = 5,5 | pH = 6,0 |
| doplnit dest. H2O do objemu | 100 ml | 200 ml | 500 ml | 100 ml | 200 ml | 500 ml |
Esterasový pufr (Esterases buffer, pH = 6,45)
| | 100 ml | 200 ml | 500 ml | (konc.) |
|---|
| NaH2PO4 . 2 H2O | 1,56 g | 3,12 g | 7,80 g | (0,1M) |
| Na2HPO4 . 12 H2O | 0,72 g | 1,43 g | 3,59 g | (0,02M) |
| dest. H2O | ~ 80 ml | ~ 180 ml | ~ 450 ml | |
| úprava pH pomocí NaOH | pH = 6,45 | |
| doplnit dest. H2O do objemu | 100 ml | 200 ml | 500 ml | |
Potassium phosphate buffer
a) zásobní 0,1M K2HPO4
| | 100 ml | 250 ml | 500 ml |
|---|
| K2HPO4 (bezv.) | 1,74 g | 4,35 g | 8,71 g |
| dest. H2O | ~ 80 ml | ~ 220 ml | ~ 450 ml |
| doplnit dest. H2O do objemu | 100 ml | 250 ml | 500 ml |
b) zásobní 0,1M KH2PO4
| | 100 ml | 250 ml | 500 ml |
|---|
| KH2PO4 (bezv.) | 1,36 g | 3,40 g | 6,80 g |
| dest. H2O | ~ 80 ml | ~ 220 ml | ~ 450 ml |
| doplnit dest. H2O do objemu | 100 ml | 250 ml | 500 ml |
c) smíchání zás. roztoků
| pH | K2HPO4 | KH2PO4 |
|---|
| 5,8 | 8,5 ml | 91,5 ml |
| 6,0 | 13,2 ml | 86,8 ml |
| 6,2 | 19,2 ml | 80,8 ml |
| 6,4 | 27,8 ml | 72,2 ml |
| 6,5 | 32,95 ml | 67,05 ml |
| 6,6 | 38,1 ml | 61,9 ml |
| 6,8 | 49,7 ml | 50,3 ml |
| 7,0 | 61,5 ml | 38,5 ml |
| 7,2 | 71,7 ml | 28,3 ml |
| 7,4 | 80,2 ml | 19,8 ml |
| 7,6 | 86,6 ml | 13,4 ml |
| 7,8 | 90,8 ml | 9,2 ml |
| 8,0 | 94 ml | 6 ml |
roztok o finální koncentraci 0,05M připravíme naředěním hotového 0,1M roztoku daného pH, upravíme pH pomocí K2HPO4 (zvýšení) nebo KH2PO4 (snížení)
6) Isozymy – fixace
Fixační roztok (podle isozymové laboratoře BÚ AVČR, Průhonice)
| | 500 ml | 1000 ml |
|---|
| Kys. octová | 50 ml | 100 ml |
| Glycerol | 50 ml | 100 ml |
| dest. H2O | 150 ml | 300 ml |
| Methanol | 250 ml | 500 ml |
7) Ostatní
1M HCl
| | 100 ml | 250 ml | 500 ml |
|---|
| dest. H2O | ~ 70 ml | ~ 200 ml | ~ 400 ml |
| konc. HCl (35%) | 8,83 ml | 22,07 ml | 44,14 ml |
| doplnit dest. H2O do objemu | 100 ml | 250 ml | 500 ml |
Roztoky NaOH
| | 0,5M NaOH | 1M NaOH | 10M NaOH |
|---|
| | 100 ml | 250 ml | 100 ml | 250 ml | 100 ml | 250 ml |
|---|
| dest. H2O | ~ 70 ml | ~ 220 ml | ~ 70 ml | ~ 220 ml | ~ 70 ml | ~ 200 ml |
| NaOH (bezvodý) | 2 g | 5 g | 4 g | 10 g | 40 g | 100 g |
| doplnit dest. H2O do objemu | 100 ml | 250 ml | 100 ml | 250 ml | 100 ml | 250 ml |
Při přípravě 0,5M NaOH pro izolaci DNA použít místo destilované vody Milli-Q vodu, vysterilizovat v autoklávu.
1M H3PO4
| | 100 ml | 250 ml | 500 ml |
|---|
| dest. H2O | ~ 70 ml | ~ 200 ml | ~ 400 ml |
| konc. H3PO4 (85%) | 6,74 ml | 16,86 ml | 33,71 ml |
| doplnit dest. H2O do objemu | 100 ml | 250 ml | 500 ml |
1M kys. octová
| | 100 ml | 250 ml | 500 ml |
|---|
| dest. H2O | ~ 70 ml | ~ 200 ml | ~ 400 ml |
| kys. octová (čistá) | 5,72 ml | 14,30 ml | 28,60 ml |
| doplnit dest. H2O do objemu | 100 ml | 250 ml | 500 ml |
Na začátek >>
