Laboratoř molekulární biologie rostlin PřF JU

AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism)

Princip

Jde o restrikční metodu, která umožňuje analýzu polymorfismu v celkové genomové DNA a nevyžaduje znalosti o struktuře geonomu (specifické primery apod.). DNA je štěpena dvěma různými restrikčními enzymy a z velkého množství vzniklých fragmentů je pomocí dvou následných PCR selektována část fragmentů. (desítky až stovky). Sleduje se přítomnost nebo nepřítomnost fragmentu určité délky.

Prvním krokem AFLP metody je restrikce. Pro štěpení DNA se používají restriktasy MseI a EcoRI, které štěpí DNA řetězec tzv. s přesahem, tj. na koncích fragmentů vznikají jenovláknové přesahy několika bazí. Na tyto volné konce se komplementárně vážou tzv. adaptory, krátké syntetické úseky dvouřetězcové DNA o známé sekvenci. Spojení adaptorů s konci restrikčních fragmentů zajišťuje enzym T4 DNA ligasa. Následuje tzv. preselektivní amplifikace, kdy PCR reakce probíhá s dvojicí primerů, které mají sekvenci komplementární k sekvenci adaptorů a obsahují jednu tzv. selektivní bázi navíc (obecně se používá C pro MseI primer a A pro EcoRI primer). Výsledkem PCR jsou fragmenty s MseI adaptorem na jednom konci a EcoRI adaptorem na druhém konci. Díky prodloužení o jednu selektivní bázi vzniká pouze 1/16 restrikčních fragmentů. Preselektované fragmenty vstupují do druhé, tzv. selektivní PCR, ve které jsou použity primery komplementární k adaptorům prodloužené o tři selektivní báze (C + dvě náhodně zvolené báze pro MseI a A + dvě náhodně zvolené báze pro EcoRI). Tím je počet fragmentů znovu redukován. EcoRI primery jsou fluorescenčně značené, což umožňuje separaci fragmentů v automatickém sekvenátoru tzv. fragmentační analýzou. Fragmenty jsou rozděleny podle délky, jejíž přesné určení umožní přidání fluorescenčně značeného standardu obsahujícího fragmenty DNA o známé délce ke každému vzorku.

Obvykle se hledá několik primerových kombinací, které pak budou odlišeny různou fluorescenční barvou EcoRI primeru a mohou být na sekvenátoru analyzovány zároveň ve směsných vzorcích. Automatický sekvenátor ABI PRISM 3130xl firmy Applied Biosystems umožňuje současně analýzu čtyř různých primerových kombinací.

Díky možnosti detekovat variabilitu na nízkých úrovních lze AFLP použít pro studium procesů v populacích, odlišení blízkých taxonů, při fylogeografických studiích apod. Existují ale i práce využívající AFLP pro studium fylogeneze i na rodové úrovni. Nevýhodou metody je poměrně vysoká cena, časová náročnost metody i požadavky na kvalitu DNA a přesné reakční podmínky při restrikci i PCR.

V současnosti je možné v naší laboratoři použít dva protokoly:

Obecné poznámky:

• Sekvenační centrum vyžaduje pro fragmentační analýzu, aby byl výsledný počet vzorků v násobcích 16.
• Během celého postupu pracujeme stále na ledu. Enzymy vyndáváme z mrazáku až těsně před jejich použitím a ihned poté vracíme zpět.
• Fluorescenčně značené primery chráníme před světlem (zkumavky obalujeme alobalem a necháváme rozmrzat např.v tmavé skříni). Pro práci používáme alikvoty.

1) Restrikce

• Využijeme AFLP® Core Reagent Kit I.
• Připravíme si restrikční směs pro patřičný počet vzorků + 1. Výsledný objem směsi je 2,5 µl na vzorek.
• sterilní H2O.................................. 1,1 µl
• 5× Reaction buffer....................... 1,0 µl
• EcoRI/MseI enzyme mixture....... 0,4 µl
• Směs promícháme, krátce centrifugujeme a rozpipetujeme po 2,5 µl do PCR stripů nebo 0,2 ml PCR zkumavek.
• Přidáme 2,5 µl DNA (koncentrace 50–100 ng/µl); výsledný objem 5 µl. Promícháme, krátce centrifugujeme na stolní centrifuze.
• Vložíme do termocykleru a inkubujeme 3 hodiny při teplotě 37°.

2) Ligace

• Využijeme AFLP® Core Reagent Kit I.
• Připravíme si restrikční směs pro patřičný počet vzorků + 1. Výsledný objem směsi je 5 µl na vzorek.
• Adaptor/Ligation Solution .......... 4,8 µl
• T4 DNA ligase ............................ 0,2 µl
• Směs promícháme, krátce centrifugujeme a přidáme po 5 µl ke vzorkům po restrikci; celkový objem 10 µl.
• Vložíme do termocykleru a spustíme restrikci: 12 hodin při teplotě 37°.

Pozn.: Nejlépe spustit odpoledne a nechat proběhnout přes noc, aby bylo možné ráno pokračovat preselektivní amplifikací.

• Po proběhnutí reakce otestujeme úspěšnost restrikce/ligace na 1,8 % agarosovém gelu v TBE pufru. Nanášíme 3–5 µl směsi po ligaci spolu se 3 µl LB a 3 µl 100 bp ladderu. Na gelu by měl být vidět „smír“ restrikčních fragmentů (zejména v oblasti 50–1000 bp).

3) Preselektivní amplifikace

• Využijeme AFLP® Pre-amp Primer Mix I .
• Připravíme si preamplifikační směs pro patřičný počet vzorků + 1. Výsledný objem směsi je 5 µl.
• PA mix .......................................... 4 µl
• PCR buffer (10×)......................... 0,5 µl
• DNA polymerasa (1 U/µl)........... 0,1 µl
• Směs promícháme, krátce centrifugujeme, a rozpipetujeme po 4,6 µl do PCR stripů nebo 0,2 ml PCR zkumavek.
• Přidáme 0,4 µl DNA po ligaci; výsledný objem 5 µl.
• Vložíme do termocykleru a spustíme program pro preselektivní amplifikaci:

• Směs po preselektivní amplifikaci naředíme 10× naředíme (2 µl preamplifikační směsi + 18 µl sterilní H2O). Zbytek nenaředěného vzorku uschováme v –20°C pro případné opakování.
• Úspěšnost preselektivní amplifikace ověříme na 1,8 % agarosovém gelu v TBE pufru. Nanášíme 3 µl (neředěné) preamplifikační směsi spolu s 3 µl LB a 3 µl 100 bp ladderu. Na gelu by měl být vidět „smír“ preamplifikačních fragmentů, na několika místech intenzivnější.

4) Selektivní amplifikace

• Připravíme si mix pro odpovídající počet vzorků + 1. Obvykle děláme pro každý vzorek 4 varianty, které se liší použitými primery (neznačený MseI a fluorescenčně značený EcoRI). Výsledný objem směsi je 7,5 µl na jeden vzorek v jedné variantě.
• Sterilní H2O ................................. 5,1 µl
• PCR buffer (10x)........................... 1 µl
• dNTP (10 mM) ............................ 0,2 µl
• EcoRI primer (1 pmol/µl)............ 0,5 µl
• MseI primer (5 pmol/µl) ............. 0,5 µl
• DNA polymerasa (1 U/µl)........... 0,2 µl
• Směs promícháme, krátce centrifugujeme a rozpipetujeme po 7,5 µl do PCR stripů nebo 0,2 ml PCR zkumavek.
• Přidáme 2,5 µl ředěné DNA po preselektivní amplifikaci, výsledný objem směsi 10 µl.
• Promícháme, krátce centrifugujeme na stolní centrifuze.
• Vložíme do cykleru a spustíme program pro selektivní amplifikaci:

5) Příprava pro fragmentační analýzu

• Připravíme směs produktů selektivní amplifikace, které pocházejí z jednoho původního vzorku (jedné směsi po preamplifikaci), ale liší se fluorescenční barvou. Smícháme po 1 µl (nebo optimalizované objemy) od každé ze čtyř barev.
• Pokud není možné odnést vzorky na fragmentační analýzu v krátké době, přesrážíme selektivní PCR produkt octanem sodným (viz protokol C).
• Připravíme si mix pro patřičný počet vzorků + 1. Formamid je v laboratoři k dispozici v alikvotech pro přípravu 17 vzorků. Výsledný objem směsi je 10,5 µl na vzorek.
• Hi-Di formamid..................................... 10,25 µl
• GeneScan 500LIZ Size standrad..............0,25 µl
• Ke směsi přidáme 0,5 µl smíchané DNA po selektivní amplifikaci. Takto připravené vzorky ihned odneseme do sekvenančního centra na fragmentační analýzu.

• Obecné poznámky viz protokol A.
• ATP je skladováno při –80°C, proto potřebné množství necháme rozmrznout v předstihu.

1) Restrikce

• DNA naředíme TE pufrem tak, abychom měli 50 ng DNA v celkovém objemu 40 µl.
• Připravíme si restrikční směs pro patřičný počet vzorků + 1. Výsledný objem směsi je 10 µl na vzorek.
• R/L buffer (koncentrace 10x).................... 5 µl
• sterilní H2O............................................. 4,25 µl
• EcoRI (koncetrace 20U/µl) .................... 0,25 µl (= 5 U)
• MseI (10U/µl)...........................................0,5 µl (= 5 U)
• Směs promícháme a rozpipetujeme po 10 µl do PCR stripů nebo 0,2 ml PCR zkumavek.
• Přidáme 40 µl DNA, výsledný objem 50 µl. Promícháme, krátce centrifugujeme na stolní centrifuze.
• Vložíme do cykleru a inkubujeme 16 hodin při teplotě 37°C

Pozn.: Nejlépe spustit odpoledne a nechat proběhnout přes noc, aby bylo možné ráno pokračovat ligací.

2) Ligace

• Připravíme si ligační směs pro odpovídající počet vzorků + 1.
• Výsledný objem směsi je 10 µl na vzorek.
• sterilní H2O.............................................. 6,2 µl
• R/L buffer (koncentrace 10x).................... 1 µl
• EcoRI 3’ adaptor (50 pmol/µl) ................ 0,1 µl (= 5 pmol)
• EcoRI 5’ adaptor (50 pmol/µl) ................ 0,1 µl (= 5 pmol)
• MseI 3’ adaptor (250 pmol/µl) ................ 0,2 µl (= 50 pmol)
• MseI 5’ adaptor (250 pmol/µl) ................ 0,2 µl (= 50 pmol)
• ATP (10 mM)........................................... 1,2 µl (= 1,2 pmol)
• T4 ligasa (1 U/µl)....................................... 1 µl = 1 U
• Směs promícháme a rozpipetujeme po 10 µl do PCR stripů nebo 0,2 ml PCR zkumavek.
• Přidáme 50 µl DNA po restrikci. Výsledný objem ligační směsi je 60 µl.
• Promícháme, krátce centrifugujeme na stolní centrifuze.
• Vložíme do cykleru a spustíme program pro ligaci: 3 hodiny při 37°C.
• Po proběhnutí reakce otestujeme úspěšnost restrikce/ligace na 1,8 % agarosovém gelu v TBE pufru. Nanášíme 10 µl směsi po ligaci spolu se 3 µl LB a 3 µl 100 bp ladderu. Na gelu by měl být vidět „smír“ restrikčních fragmentů (zejména v oblasti 50–1000 bp).
• Směs po ligaci 10x naředíme (5 µl ligační směsi + 45 µl T0.1E pufru).
• Zbytek nenaředěného vzorku po ligaci uschováme v –20°C pro případné opakování (naředěných 50 µl stačí pro 10 preamplifikačních reakcí).

3) Preselektivní amplifikace

• Připravíme si mix pro patřičný počet vzorků + 1. Výsledný objem směsi je 45 µl na vzorek.
• Sterilní H2O ............................................ 30,5 µl
• PCR buffer (10x)....................................... 5 µl
• MgCl2 (25 mM)......................................... 8 µl (= 4 mM)
• dNTP (10 mM) .......................................... 1 µl (= 0.2 mM)
• EcoRI+A primer (500 ng/µl).................. 0,15 µl (= 75 ng)
• MseI+C primer (500 ng/µl) .................... 0,15 µl (= 75 ng)
• DNA polymerasa (5 U/µl)....................... 0,2 µl (= 1 U)
• Směs promícháme a rozpipetujeme po 45 µl do PCR stripů nebo 0,2 ml PCR zkumavek.
• Přidáme 5 µl naředěné DNA po ligaci. Výsledný objem směsi je 50 µl.
• Promícháme, krátce centrifugujeme na stolní centrifuze.
• Vložíme do cykleru a spustíme program pro preselektivní amplifikaci:

• Úspěšnost preselektivní amplifikace ověříme na 1,2 % agarosovém gelu v TBE pufru. Nanášíme 10 µl preamplifikační směsi spolu s 3 µl LB a 3 µl 100 bp ladderu. Na gelu by měl být vidět „smír“ preamplifikačních fragmentů, na několika místech intenzivnější.
• Směs po preselektivní amplifikaci 20× ředíme (5 µl preamplifikační směsi + 95 µl TE pufru). Zbytek nenaředěného vzorku uschováme v –20°C pro případné opakování.

4) Selektivní amplifikace

• Připravíme si mix pro odpovídající počet vzorků + 1. Obvykle děláme pro každý vzorek 4 sady vzorků, které se liší použitými primery (neznačený MseI a fluorescenčně značený EcoRI). Výsledný objem směsi je 7,5 µl na jeden vzorek v jedné sadě.
• Sterilní H2O ............................................. 4,5 µl
• PCR buffer (10x)....................................... 1 µl
• MgCl2 (25 mM)....................................... 0,6 µl (= 1,5 mM)
• dNTP (10 mM) ........................................ 0,2 µl (= 0.2 mM)
• MseI+CNN primer (300 ng/µl) ............... 0,1 µl (= 30 ng)
• EcoRI+ANN primer (5 ng/µl) ................... 1 µl (= 5 ng)
• DNA polymerasa (5 U/µl)....................... 0,1 µl (= 0,5 U)
• Směs promícháme, krátce centrifugujeme a rozpipetujeme po 7,5 µl do PCR stripů nebo 0,2 ml PCR zkumavek.
• Přidáme 2,5 µl ředěné DNA po preselektivní amplifikaci, výsledný objem směsi je 10 µl.
• Promícháme, krátce centrifugujeme na stolní centrifuze.
• Vložíme do cykleru a spustíme program pro selektivní amplifikaci:

5) Příprava pro fragmentační analýzu

• Připravíme směs produktů selektivní amplifikace, které pocházejí z jednoho původního vzorku (jedné směsi po preamplifikaci), ale liší fluorescenční barvou. Smícháme po 1 µl (nebo optimalizované objemy) od každé ze čtyř barev.
• Pokud není možné odnést vzorky na fragmentační analýzu v krátké době, přesrážíme selektivní PCR produkt octanem sodným (viz protokol C).
• Připravíme si mix pro patřičný počet vzorků + 1. Formamid je v laboratoři k dispozici v alikvotech pro přípravu 17 vzorků. Výsledný objem směsi je 10,5 µl na vzorek.
• Hi-Di formamid..................................... 10,25 µl
• GeneScan 500LIZ Size standrad..............0,25 µl
• Ke směsi přidáme 0,5 µl smíchané DNA po selektivní amplifikaci. Takto připravené vzorky ihned odneseme do sekvenančního centra na fragmentační analýzu.

Všechny centrifugační kroky probíhají při 4°C v předem vychlazené centrifuze.

• Na stěnu 1,5 ml eppendorfky pipetujeme 1 µl 3M octanu sodného.
• Do kapky octanu sodného přidáme 3 µl směsi DNA po selektivní amplifikaci.
• Přidáme 25 µl čistého 96% ethanolu.
• Promícháme na vortexu, krátce stočíme na stolní centrifuze.
• Necháme stát 20 min v mrazáku při –20°C.
• Centrifigujeme 30 min při 14 000 rpm. Eppendorfky v centrifuze orientujeme do stejné pozice, abychom měli DNA usazenou vždy na stejném místě.
• Pomalu a opatrně slijeme supernatant, DNA zůstává usazená na stěně eppendorfky.
• Přidáme 100 µl 70% ethanolu.
• Centrifigujeme 5 min při 14 000 rpm.
• Pomalu a opatrně slijeme supernatant, DNA zůstává na stěně eppendorfky.
• Otevřené eppendofky necháme stát ve stojánku 5 min při laboratorní teplotě a následně dosušíme 10 min v termobloku při 65°C.
• Skladujeme v lednici (4°C).
• Před přípravou pro fragmentační analýzu rozpustíme ve 3 µl sterilní destilované vody (nebo TE pufru).