PCR-RFLP (Restriction Fragment Lenght Polymorphism)
Princip
Metoda využívá tzv. restrikčních endonukleas, které specificky štěpí řetězec DNA. Např. enzym EcoRI rozštěpí DNA vždy, pokud nalezne sekvenci 3´-GAATTC-5´. Vlastní postup se skládá z PCR amplifikace určitého úseku DNA a jeho štěpení vybranou restriktasou. Restrikční fragmenty dělíme elektroforeticky podle velikosti. Pokud PCR produkt obsahuje právě jedno štěpné místo, získáme dva kratší fragmenty nebo více fragmentů, pokud je štěpných míst více. Restrikční místa mohou mutacemi zanikat i vznikat. Hledáme polymorfismus ve štěpných místech a ten pak interpretujeme jako genetickou podobnost studovaných organismů.
Postup
1) PCR amplifikace
- Viz obecný protokol pro PCR.
- Výsledek PCR ověřujeme standardním způsobem. Pro PCR-RFLP je důležité, aby byl na gelu pouze jeden specifický pruh.
2) Restrikce
Každá restriktáza má svůj specifický restrikční pufr, ve kterém vykazuje maximální aktivitu. Restrikční pufry jsou dodávány s příslušným enzymem, např. od firmy Fermentas, Takara nebo NEB (plakát na zdi vedle mrazáku) a zajišťují stálé optimální pH během restrikce. Stálou optimální teplotu pro restrikční reakci pak zajistíme v termostatu nebo termocykleru.
- Pracujeme stále na ledu.
- Do sterilní 1,5 ml eppendorfky připravíme restrikční směs, tj. sterilní voda, restrikční pufr a restrikční enzym pro příslušný počet vzorků + 1.
- Promícháme pipetováním a do jednotlivých PCR zkumavek rozpipetujeme příslušný objem na jednu reakci. Přidáme DNA, promísíme a zkumavky vložíme na 4 h nebo přes noc do termocykleru nastaveného na teplotu 37 °C.
- Příklad restrikční reakce o objemu 16 µl s jedním enzymem:
- sterilní voda.......................................... 11,1 µl
- restrikční pufr (koncentrace 10×)........... 2 µl
- restrikční enzym (10 U/µl).................... 0,3 µl
- DNA........................................................4 µl (cca 100 ng)
- Příklad restrikční reakce o objemu 30 µl s jedním enzymem:
- sterilní voda.......................................... 19,5 µl
- restrikční pufr (koncentrace 10×)........... 3 µl
- restrikční enzym (10 U/µl).................... 1,5 µl
- DNA........................................................6 µl (cca 1 µg)
- Do každé restrikční reakce přidáme 2 µl nanášecího pufru LB (barvička zastaví restrikční reakci) a naneseme na 1 % agarosový gel v TBE pufru spolu se 6 µl 100 bp žebříčku. Pro větší rozlišení lze použít vertikální polyakrylamidový gel.
