Laboratoř molekulární biologie rostlin PřF JU

Polymerázová řetězová reakce
PCR (Polymerase Chain Reaction)

Princip

Polymerázová řetězová reakce byla objevena v roce 1983 Kary Mullisem (Nobelova cena za chemii). Jde o jednoduchou metodu zmnožení (amplifikace) určité části DNA in vitro.

Základní uspořádání PCR vyžaduje vytvoření směsi reagencií a následné cyklické střídání teplot této směsi.

Složky PCR (PCR mix)

PCR teplotní program

Cyklické střídání teplot umožňuje přístroj zvaný termocykler.

Střídáním tří teplot dochází k exponenciálnímu množení požadovaného úseku DNA vymezeného dvojicí použitých primerů. Počet cyklů u běžné PCR se pohybuje od 25 do 40. Výsledkem PCR je pak 225-240 kopií příslušného úseku DNA z každé molekuly templátové DNA. DNA lze vizualizovat po inkorporaci UV fluorescenčního barviva (např. Syber Green, ethidiumbromid ) do dvoušroubovice DNA pod UV světlem.

Optimalizace PCR

Cílem optimalizace je specifický průběh PCR reakce, tj. aby vznikal pouze jediný produkt odpovídající amplifikovanému úseku. Výsledek PCR reakce proto ověřujeme na gelu. V případě, že produkt PCR reakce není zřetelný nebo je výsledkem více produktů odlišné délky (nespecifické produkty), reakce neproběhla optimálně. Je nutné změnit reakční podmínky tak, aby PCR proběhla úspěšně. Je několik možností:

PCR protokol s využitím Plain PP Master Mixu (Top-Bio)

Plain PP Master Mix již obsahuje PCR pufr, hořčík, nukleotidy a DNA polymerázu. Jeho použitím se výrazně snižuje čas nutný pro přípravu PCR reakce. Snížením počtu pipetovacích kroků je eliminována chybovost při přípravě.
Postup

reagencie objem (µl) výsledná
koncentrace
sterilní Milli-Q voda 9,5 -
2 × Plain PP Master Mix 12,5 1 ×
5' primer 1 0,1-1µM
3' primer 1 0,1-1µM

Plain PP Master Mix ve finální koncentraci obsahuje 75mM Tris/HCl, pH 8,8; 20mM (NH4)2SO4; 0,01% Tween20; 2,5mM MgCl2; 200µM dATP, 200µM dCTP, 200µM dTTP, 200µM dGTP; 1,25 U Taq DNA polymerázy.

  • Příslušný objem PCR směsi (v tomto případě 24 µl) rozpipetujeme do jednotlivých 0,2 ml PCR zkumavek a přidáme 1 µl DNA. Promícháme, krátce stočíme v centrifuze.
  • Zkumavky vložíme do termocykleru s příslušným teplotním programem.
  • Po proběhnuté reakci smísíme cca 5 µl DNA s 2 µl LB pufru a otestujeme amplifikovaný produkt nanesením směsi na 1,5% agarosový gel v TBE pufru. Jako standard naneseme 6 µl 100bp ladderu firmy NEB.
  • Web: janchlumsky@seznam.cz