Analýza mikrosatelitů
Princip
Mikrosatelitní DNA neboli mikrosatelity, také nazývané STR (short tandem repeats – krátká tandemová opakování) nebo SSR (simple sequence repeats), jsou krátké segmenty DNA, ve kterých se mnohokrát opakují specifické motivy nukleotidových sekvencí. Nejčastěji jsou tvořeny opakováním mono-, di-, tri- nebo tetranukleotidů, např. (A)n, (AT)n, (ATA)n apod. Počet opakování jednotky (repetice) v konkrétním místě DNA (lokusu) definuje alelu. Každý jedinec má v jaderné DNA dvě kopie každého mikrosatelitu, jeden zděděný po matce, druhý po otci. U diploidních jedinců tak můžeme odhalit dvě alely, u tetraploidních až čtyři atd.
Délku alel(y) zjistíme PCR amplifikací daného lokusu pomocí primerů přiléhajících k mikrosatelitní sekvenci. Pro analýzu mikrosatelitů tedy potřebujeme znát okolní sekvence. PCR fragmenty pak rozdělíme podle délky v automatickém sekvenátoru tzv. fragmentační analýzou. Ke každému vzorku se přidá fluorescenčně značený standard (500-LIZ), obsahující fragmenty DNA o známé délce, aby bylo později možné identifikovat délku každého fragmentu (alely) a jednoznačně ji srovnávat s délkou fragmentů v jakémkoliv jiném běhu.
Mikrosatelity jsou považovány za jedny z nejvhodnějších genetických markerů díky jejich hojnému výskytu v celém genomu, extrémní variabilitě (polymorfismu) a kodominantní dědičnosti (umožňuje rozlišit heterozygoty). V populační biologii nachází využití při identifikaci příbuzných jedinců, až po odvozování demografických parametrů.
Jaderné mikrosatelity jsou často velmi druhově specifické, musíme tedy pracovat s druhem, pro nějž jsou primery již publikované. Používají se na vnitrodruhové úrovni. Chloroplastové mikrosatelity se naopak vyskytují v místech mezi konzervovanými sekvencemi. Na základě tzv. konsenzuálních primerů můžeme určité lokusy amplifikovat pro druhy z mnoha různých čeledí. Jsou tedy využitelné pro hodnocení variability mezi druhy.
Postup
1) PCR
Pro amplifikaci konkrétního úseku DNA, který obsahuje repetitivní mikrosatelitovou sekvenci použijeme dva specifické primery, jeden z primerů je fluorescenčně značený (používáme barvy 6-FAM, VIC, NED a PET).
Pokud je třeba analyzovat více mikrosatelitových lokusů (často se analyzuje 8-10), je výhodné pokusit se sestavit tzv. multiplex PCR. Je to v podstatě běžná PCR reakce, do které přidáme více primerových páru najednou a amplifikujeme tak více lokusů (až třeba pět) v jedné PCR reakci. Můžeme tak výrazně snížit finanční i časové náklady na analýzu. Pro úspěšnou a dostatečnou amplifikaci všech lokusů musíme zaručit, aby (1) primery měly přibližně stejnou teplotu annealingu, (2) primery v jedné PCR reakci nevytvářely dimery, (3) lokusy s překrývajícím se rozsahem předpokládaných délek fragmentů byly označeny jinou fluorescenční barvou.
- Do 1.5 ml eppendorfky napipetujeme směs pro příslušný počet vzorků + 1. Pracujeme stále na ledu.
- sterilní Milli-Q voda ......................... 5,7 µl
- 2 × Plain PP Master Mix (Top-Bio).. 7,5 µl
- forward primer (10 pmol/µl) .......... 0,4 µl
- reverse primer (10 pmol/µl) ............ 0,4 µl
- Promícháme na vortexu, krátce stočíme v centrifuze a po 14 µl pipetujeme do PCR zkumavek (případně stripů).
- Přidáme 1 µl naředěné DNA (5 ng/µl), promícháme na vortexu a vložíme do termocykleru s příslušným teplotním programem.
- Po proběhnutí reakce otestujeme úspěšnost amplifikace na 1% agarosovém gelu v TBE pufru.
Příprava pro fragmentační analýzu
- Připravíme směs osahující 0,25 µl velikostního standardu (Size standard, 500-LIZ), 0,5 µl od každého PCR produktu a doplníme deionizovaným formamidem (tzv. Hi-Di formamid = high deionized) na výsledný objem 10 µl.
- Postupujeme tak, že si nejprve připravíme směs formamidu a velikostního standardu pro příslušný počet vzorků +1.
- Promícháme, krátce stočíme, a rozpipetujeme do označených 0,5 ml eppendorfek.
- Přidáme PCR produkt(y).
- Promícháme na vortexu, krátce stočíme v centrifuze a odneseme do sekvenního centra
